1560 begann der Architekt Giorgio Vasari auf Auftrag Cosimo I de' Medicis mit dem Bau des prächtigen Gebäudekomplexes der Uffizien zur Unterbringung der Ämter von 13 Künsten sowie von Richterämtern. Das 1580 fertiggestellte Obergeschoß war dazu bestimmt, die Kunstsammlungen der Medici aufzunehmen.
Noch heute beherbergen die Uffizien berühmte Meisterwerke der Kunst, die in chronologischer Abfolge ausgestellt sind. Beginnend bei der großen romanischen Malerei Cimabues wird der Verlauf von der Revolution in der Gotik durch Giotto hin zur dekorativen Fülle der Spätgotik bei Gentile da Fabrianos veranschaulicht. Die Werke Masaccios, Paolo Uccellos, Piero della Francescas und Filippo Lippis legen Zeugnis von den neuen Errungenschaften der Renaissance ab, während die bedeutenden Florentiner Zeiten Lorenz' des Prächtigen durch Sandro Botticellis Meisterwerke Geburt der Venus und Allegorie des Frühlings repräsentiert werden. Die Ausstellung setzt sich dann mit Gemälden Leonardo da Vincis und dem einzigen von Michelangelo dokumentierten Gemälde, dem Tondo Doni, fort um letztendlich zu den berühmten Werken Raffaels und Tizians zu gelangen. Eine umfangreiche Sektion ist dem Bacchus und der Medusa von Caravaggio sowie den Anhängern des Meisters, darunter auch die berühmte Artemisia Gentileschi, gewidmet. Der Museumsrundgang endet mit der neoklassizistischen Malerei des 18.Jahrhunderts, die den Auftakt der modernen Kunst darstellt.
