Em 1560 o arquiteto Giorgio Vasari começou, a pedido de Cosimo I de Médici, construir o majestoso Palacio Uffizi para colocar todos os escritórios das artes e das 13 magistraturas. O último andar do edificio , terminado em 1580, foi destinado às coleções de obras de arte dos Médici. O Palacio Uffizi inclui ainda hoje obras-primas de pintura, expostas por ordem cronológica.
A partir da grande pintura románica de Cimabue, o percurso ilustra a revolução gótica de Giotto até a riqueza decorativa do gótico tardio de Gentile da Fabriano. Testamunham as novidades do Renascimento: Masaccio, Paolo Uccello, Piero della Francesca e Filippo Lippi, porém a grande estação de Florença na época de Lourenço o Magnífico está representada pelas obras-primas de Sandro Botticelli, o Nascimento de Venus e a Alegoria da Primavera. A exposição prossegue com os quadros de Leonardo da Vinci, o único quadro documentado de Miguelangelo, o Tondo Doni, para chegar às famosas obras de Rafael e Tiziano. Uma larga seção inclui o Bacco e a Medusa de Caravaggio e obras dos seguidores do mestre, como a famosa Artemisia Gentileschi. O percurso do museu acaba com a pintura neoclássica de 1700, prelúdio à pintura moderna
