Das Museum, das im 18. Jahrhundert auf Wunsch des Großherzoges Peter Leopold als Gemäldegalerie geschaffen wurde, wurde 1873 dazu bestimmt, den David von Michelangelo zu beherbergen. Dieser wurde deshalb von seinem Standort im Freien auf der Piazza della Signoria dorthin gebracht.
Das große Meisterwerk, welches Ausdruck des Genies des jungen Künstlers und Symbol der Freiheit der Florentiner Republik zu Beginn des 16. Jahrhunderts ist, dominiert den extra für ihn vom Architekten de Fabris geschaffenen Raum. In der Folgezeit wurden weitere Statuen Michelangelos hierher gebracht, so dass die Galerie definitiv zu einem Michelangelo-Museum wurde: die vier unvollendeten Gefangenen, die für das Grab des Papstes Julius II bestimmt waren, aber nie nach Rom gebracht wurden, sowie der ebenfalls nicht vollendete Hl. Matthäus für den Florentiner Dom und die Palestrina Pietà, die zu seinen Spätwerken zählt.
